Spektrofotometr UV-Vis

Spektrofotometr odpowiada na inny rodzaj pytania niż większość przyrządów, obok których stoi. Nie raportuje bezpośrednio właściwości próbki; raportuje, ile światła próbka zaabsorbowała przy długości fali wybranej przez kogoś, a wszystko inne , stężenie, czystość, czy reakcja poszła tam, gdzie miała , jest z tego wnioskowane. Wybór ustalający wszystko, co następuje, to więc zakres długości fali, jaki przyrząd może osiągnąć, i jak drobno może je rozdzielać.

Ten zakres obejmuje dziewięć modeli w dwóch seriach. Seria V pracuje w obszarze widzialnym na lampie wolframowej; seria UV dodaje lampę xenonową i sięga do 190 nm. Szerokość pasma biegnie w nich od 5 nm do 1,8 nm, dokładność długości fali od 2 nm do ±0,5 nm, a wszystkie oprócz jednego modelu są jednowiązkowe.

Co przyrząd mierzy

Raportowane są cztery wielkości: transmitancja, absorbancja, stężenie i współczynnik nachylenia łączący dwie ostatnie. Transmitancja to ułamek światła padającego przechodzącego przez próbkę. Absorbancja to jej ujemny logarytm, czyli wielkość proporcjonalna do stężenia w zakresie roboczym i ta, w której prowadzona jest większość pomiarów. Stężenie wynika z absorbancji przez współczynnik ustalony względem wzorców o znanym stężeniu, a współczynnik nachylenia jest tym przeliczeniem przechowywanym przez przyrząd.

Ponieważ zależność między absorbancją a stężeniem jest liniowa tylko w granicach, użyteczny zakres pomiarowy jest węższy, niż sugerowałaby skala. Próbka zbyt stężona odczytuje się, jakby była rozcieńczona, bo zależność przestaje być liniowa, zanim detektor wyczerpie sygnał. To jest własność metody, a nie przyrządu, i dlatego wybór drogi optycznej i rozcieńczenia ma takie samo znaczenie jak wybrany model.

Jak wykonywany jest pomiar

Światło z lampy jest rozpraszane przez holograficzną siatkę dyfrakcyjną 1 200 linii na milimetr w monochromatorze Czerny’ego-Turnera, który zamienia szerokie wyjście w wąskie pasmo przy wybranej długości fali. Ta wiązka monochromatyczna przechodzi przez próbkę, a natężenie docierające do detektora jest porównywane z natężeniem, które dotarło przez odniesienie. Stosunek to transmitancja, a logarytm jej odwrotności to absorbancja.

Trzy rzeczy wynikają z tego układu. Pierwsza to taka, że źródło i detektor są tak samo częścią pomiaru jak próbka, i dlatego żywotność źródła i dryft pojawiają się w specyfikacji. Dryft jest podany jako ≤0,003 A w każdym modelu i to jest wartość decydująca o tym, czy mała różnica absorbancji może być wiarygodna w długiej serii. Druga to taka, że monochromator ustala rozdzielczość: siatka jest wspólna dla zakresu, ale szerokość szczeliny za nią, podana jako szerokość pasma spektralnego, nie jest, i to szerokość pasma, a nie siatka, decyduje o tym, czy dwa bliskie piki pozostają rozdzielone. Trzecia to taka, że odniesienie ma znaczenie. Każdy pomiar jest stosunkiem, więc wszystko, co zmienia się między odniesieniem a odczytem próbki, trafia do wyniku, chyba że optyka mierzy obie jednocześnie lub przyrząd jest zerowany ponownie wystarczająco często.

Wybór między serią widzialną a ultrafioletową

Seria widzialna sięga 320-1100 nm, z wyjątkiem LC-V1200E, gdzie zakres wynosi 350-1050 nm. Seria ultrafioletowa sięga 190-1100 nm w każdym modelu, a dodatkowy zakres pochodzi z lampy xenonowej obok wolframowej. Nic innego w specyfikacji tego nie rozstrzyga: metoda napisana poniżej ok. 320 nm nie może być uruchomiona na przyrządzie widzialnym, bo nie ma tam światła do absorpcji, a metoda napisana powyżej tej długości fali nie potrzebuje serii ultrafioletowej, chyba że coś innego w tym samym laboratorium potrzebuje.

Gdy oba obszary są potrzebne z jednego przyrządu, seria UV pokrywa obszar widzialny w tej samej obudowie, więc nie ma powodu, by kupować dodatkowo serię widzialną. Gdy praca jest całkowicie w obszarze widzialnym i laboratorium nie ma zamiaru schodzić poniżej 320 nm, modele widzialne osiągają te same długości fali tą samą siatką przy niższym koszcie specyfikacji.

Szerokość pasma i dlaczego decyduje o rozdzieleniu pików

Szerokość pasma spektralnego to szerokość pasma długości fali, które przyrząd faktycznie przepuszcza przy danym ustawieniu, i biegnie tu od 5 nm do 1,8 nm. Szerokość pasma nie jest po prostu grubszym odczytem: uśrednia wszystko w tym oknie 5 nm, więc dwa piki absorpcji leżące w odległości kilku nanometrów od siebie są raportowane jako jeden szeroki garb i żadna staranność w innym miejscu ich nie odzyska. Wymaganiem jest szerokość pasma wygodnie węższa niż mierzony pik, a gdy metoda podaje szerokość piku, szerokość pasma można dobrać bezpośrednio względem niej.

To jest powód, dla którego zakres obejmuje czynnik prawie trzykrotny w szerokości pasma między dziewięcioma modelami. Gdy metoda odczytuje szeroki pik widzialny przy stałej długości fali, szerokość pasma 4 nm lub 5 nm nie jest kompromisem. Gdy metoda obejmuje ostry pik, ramię lub dwa piki, które mają być rozdzielone, modele 1,8 nm lub 2 nm są tymi, które to potrafią.

Pojedyncza długość fali a skanowanie

Modele podstawowe są ustawione na pojedynczą długość fali i odczytują próbkę tam, co jest tym, czego potrzebuje rutynowe oznaczenie i co jest najszybszym sposobem jego przeprowadzenia. Modele N i NC oraz Pro i 1800 skanują: długość fali przesuwa się ciągle i widmo jest rejestrowane w zakresie, co jest wymagane do zlokalizowania piku, porównania próbki z widmem odniesienia lub stwierdzenia, że nic nieoczekiwanego nie absorbuje w innym miejscu zakresu.

Skanowanie nie jest tylko do pracy badawczej. Każda metoda, która ma być walidowana w laboratorium, lub która może być zakłócona przez substancję interferującą, jest łatwiejsza do obrony z widmem niż z pojedynczym punktem, a widmo zrobione raz często usuwa późniejszy spór. Gdy metoda jest ustalona przy jednej długości fali i odpowiedzią jest po prostu liczba przy tej długości fali, praca z pojedynczą długością fali nie jest ograniczeniem i modele skanujące nie są potrzebne.

Jednowiązkowy i dwuwiązkowy

Osiem z dziewięciu modeli to przyrządy jednowiązkowe, które mierzą odniesienie i próbkę w różnych momentach i polegają na ponownym zerowaniu, by utrzymać je porównywalnymi. LC-UV1800 jest dwuwiązkowy, który dzieli światło tak, że próbka i odniesienie są mierzone jednocześnie i każda zmiana wpływająca na obie jest ciągle niwelowana. W przyrządzie jednowiązkowym dryft źródła, dryft detektora i zmiana temperatury w komorze wchodzą do wyniku między odczytem odniesienia a odczytem próbki; okresowe ponowne zerowanie usuwa większość tego, i dlatego przyrządy jednowiązkowe pozostają całkowicie wystarczające do pracy rutynowej.

Różnica staje się warta dopłaty w dwóch sytuacjach: pomiar, który musi być stabilny przez długi czas, i metoda, w której różnica absorbancji między próbką a odniesieniem jest na tyle mała, że dryft jest jej znaczącą częścią. LC-UV1800 ma też najwęższą szerokość pasma w zakresie, 1,8 nm, więc jest to przyrząd dla laboratorium, które potrzebuje zarówno wąskiej szerokości pasma, jak i stabilności, a nie takiego, które chce po prostu szczyt listy.

Kuvety, komora i materiały zużywalne

Każdy model jest dostarczany z czteropozycyjnym uchwytem kuwet, albo stałym uchwytem 1 cm, albo w niektórych modelach przestawnym uchwytem 0,5-5 cm, i pudełkiem czterech kuwet szklanych 1 cm. Modele UV dodają dwie kuwety kwarcowe. To jest zestaw, a punkt do zapamiętania jest taki, że szkło nie przepuszcza w ultrafiolecie: każdy pomiar poniżej ok. 320 nm potrzebuje kuwet kwarcowych, są one dostarczane tylko z modelami UV i trzeba je zamówić oddzielnie. Dodatkowe kuwety kwarcowe są pozycją zamówieniową samą w sobie, a nie akcesorium, które można pożyczyć z innego przyrządu.

Droga optyczna uchwytu ma znaczenie w ten sam sposób co szerokość pasma: absorbancja jest proporcjonalna do odległości, jaką światło podróżuje przez próbkę, więc uchwyt 0,5 cm i 5 cm mierzą różne ilości tego samego roztworu. Gdy metoda podaje drogę optyczną, uchwyt musi ją dopasować, a gdy rozcieńczoną próbkę trzeba odczytać bez zagęszczania, dłuższa droga optyczna podnosi absorbancję do użytecznego zakresu.

Ograniczenia pomiaru i uwagi dotyczące doboru

Kilka parametrów mających znaczenie w laboratorium nie są podane nigdzie w materiale: zasilanie sieciowe, czas nagrzewania, granice temperatury otoczenia i wilgotności, odstęp wymiany źródła, stopień ochrony obudowy i żywotność źródła światła dla każdego modelu. Nic nie jest wywnioskowane, by wypełnić te luki, a własna uwaga materiału, że jego wartości to wartości nominalne dostawcy, do potwierdzenia względem tabliczki znamionowej i instrukcji dostarczonej, odnosi się do całej strony.

Dwa ograniczenia robocze warto podać wprost. Przyrząd waży od 7 kg do 12,5 kg zależnie od modelu i jest przyrządem nabiurkowym, którego droga optyczna jest wrażliwa na drgania, więc należy do stabilnej ławy, a nie do wspólnego wózka. A lampy to materiały zużywalne o znamionowanej żywotności 1 000 h lub 2 000 h według modelu, co materiał odnotowuje jako skracane przez częste włączanie, więc przyrząd używany przez cały dzień roboczy lepiej pozostawić pracujący niż włączać i wyłączać przy każdym pomiarze.

Gdy przyrząd ma być używany do badań regulowanych, dokumenty kwalifikacyjne są oddzielnym wymaganiem. Materiał odnotowuje, że dokumenty certyfikacyjne zostały usunięte u źródła i że nie dołączono informacji o certyfikatach, i zaleca zażądanie od dostawcy certyfikatu dopuszczenia typowego i dokumentów walidacji 3Q do badań farmaceutycznych i żywnościowych. To jest pytanie do zapytania, a nie założenie z dostawy.

Zamawianie

O odpowiedzi decydują: długość fali lub długości fali używane przez metodę, szerokość piku i stąd wymagana szerokość pasma, czy praca z pojedynczą długością fali wystarcza, czy widmo musi być rejestrowane, czy obszar ultrafioletu jest w ogóle potrzebny, droga optyczna kuwet, czy wyniki muszą być przechwytywane na komputerze i jakie dokumenty wymaga system jakości laboratorium. Należy podać metodę, a nie tylko model, gdzie to możliwe, bo długość fali i szerokość piku ustalają listę modeli, a nie odwrotnie. Ilość, port docelowy i wymagany termin dostawy uzupełniają zapytanie.