Espectrofotómetro UV-Vis

Un espectrofotómetro responde a un tipo de pregunta distinto del de la mayoría de los instrumentos que tiene al lado. No informa directamente de una propiedad de la muestra; informa de cuánta luz absorbió la muestra a una longitud de onda que alguien eligió, y todo lo demás (concentración, pureza, si una reacción fue adonde debía) se deduce de ahí. La decisión que fija todo lo que viene después es, por tanto, a qué longitudes de onda llega el instrumento y con qué finura puede separarlas.

Esta gama abarca nueve modelos en dos series. La serie V trabaja en la región visible con una lámpara de tungsteno; la serie UV añade una lámpara de xenón y baja hasta 190 nm. Entre ambas, el ancho de banda va de 5 nm a 1,8 nm, la exactitud de longitud de onda de 2 nm a ±0,5 nm, y todos los modelos menos uno son de haz simple.

Qué mide el instrumento

Se informan cuatro magnitudes: transmitancia, absorbancia, concentración y el factor de pendiente que conecta las dos últimas. La transmitancia es la fracción de la luz incidente que atraviesa la muestra. La absorbancia es su logaritmo negativo, que es la magnitud proporcional a la concentración dentro del intervalo de trabajo y en la que se toman en la práctica la mayoría de las mediciones. La concentración se deduce de la absorbancia mediante un factor establecido frente a patrones de concentración conocida, y el factor de pendiente es esa conversión, que el instrumento guarda.

Como la relación entre absorbancia y concentración solo es lineal dentro de unos límites, el intervalo útil de medición es más estrecho de lo que sugiere la escala. Una muestra demasiado concentrada se lee como si estuviera diluida, porque la relación deja de ser lineal antes de que el detector se quede sin señal. Eso es una propiedad del método y no del instrumento, y es la razón de que la elección del paso óptico y de la dilución importe tanto como el modelo elegido.

Cómo funciona la medición

La luz de la lámpara se dispersa mediante una red de difracción holográfica de 1200 líneas por milímetro en un monocromador Czerny-Turner, que convierte la salida ancha en una banda estrecha a una longitud de onda elegida. Ese haz monocromático atraviesa la muestra, y la intensidad que llega al detector se compara con la que llegó a través de una referencia. La relación es la transmitancia, y el logaritmo de su inversa es la absorbancia.

De esa disposición se derivan tres cosas. La primera es que la fuente y el detector forman parte de la medición tanto como la muestra, que es la razón de que la vida de la fuente y la deriva aparezcan en la especificación. La deriva se declara como ≤0,003 A en todos los modelos, y es la cifra que decide si una diferencia de absorbancia pequeña es fiable a lo largo de una serie larga. La segunda es que el monocromador fija la resolución: la red es común a toda la gama, pero la anchura de rendija que hay detrás, declarada como ancho de banda espectral, no lo es, y es el ancho de banda y no la red lo que decide si dos picos próximos siguen separados. La tercera es que la referencia importa. Toda medición es una relación, así que cualquier cosa que cambie entre la referencia y la lectura de la muestra acaba en el resultado, salvo que la óptica mida ambas al mismo tiempo o que el instrumento se ponga a cero con la frecuencia suficiente.

Elegir entre la serie visible y la ultravioleta

La serie visible llega a 320-1100 nm, excepto en el LC-V1200E, donde el intervalo es 350-1050 nm. La serie ultravioleta llega a 190-1100 nm en todos los modelos, y el intervalo adicional procede de una lámpara de xenón junto a la de tungsteno. Nada más de la especificación decide esto: un método escrito por debajo de unos 320 nm no puede ejecutarse en un instrumento visible, porque ahí no hay luz que absorber, y un método escrito por encima de esa longitud de onda no necesita la serie ultravioleta salvo que algo más en el mismo laboratorio sí lo necesite.

Cuando se necesitan las dos regiones en un solo instrumento, la serie UV cubre la región visible en el mismo equipo, así que no hay motivo para comprar además la serie visible. Cuando el trabajo es enteramente en la región visible y el laboratorio no tiene intención de bajar de 320 nm, los modelos visibles alcanzan las mismas longitudes de onda con la misma red a un coste de especificación menor.

El ancho de banda y por qué decide si dos picos se resuelven

El ancho de banda espectral es la anchura de la banda de longitudes de onda que el instrumento deja pasar realmente en cada ajuste, y aquí va de 5 nm a 1,8 nm. Un ancho de banda grande no es simplemente una lectura más gruesa: promedia todo lo que hay dentro de esa ventana de 5 nm, de modo que dos picos de absorción separados por unos pocos nanómetros se informan como un único hombro ancho, y ningún cuidado puesto en otro punto los recupera. El requisito es un ancho de banda cómodamente más estrecho que el pico que se va a medir, y cuando un método indica una anchura de pico el ancho de banda puede elegirse directamente contra ella.

Esa es la razón de que la gama abarque un factor de casi tres en ancho de banda a lo largo de nueve modelos. Cuando un método lee un pico visible ancho a una longitud de onda fija, un ancho de banda de 4 nm o 5 nm no es un compromiso. Cuando el método implica un pico agudo, un hombro o dos picos que hay que separar, los modelos de 1,8 nm o 2 nm son los que pueden hacerlo.

Longitud de onda única o barrido

Los modelos básicos se ajustan a una longitud de onda y leen la muestra ahí, que es lo que necesita una determinación de rutina y la forma más rápida de ejecutarla. Los modelos N y NC y los modelos Pro y 1800 barren: la longitud de onda se desplaza de forma continua y el espectro se registra a lo largo de un intervalo, que es lo que se requiere para localizar un pico, para comparar una muestra con un espectro de referencia o para establecer que nada inesperado absorbe en otro punto del intervalo.

El barrido no es solo para trabajo de investigación. Cualquier método que tenga que validarse en el laboratorio, o que pueda verse alterado por una sustancia interferente, se defiende mejor con un espectro que con un punto único, y un espectro tomado una vez elimina a menudo una discusión posterior. Cuando un método está fijado a una longitud de onda y la respuesta es simplemente el número a esa longitud de onda, el funcionamiento a longitud de onda única no es una limitación y los modelos de barrido no hacen falta.

Haz simple y doble haz

Ocho de los nueve modelos son de haz simple, que mide la referencia y la muestra en momentos distintos y se apoya en la puesta a cero para mantenerlas comparables. El LC-UV1800 es de doble haz, que divide la luz de modo que la muestra y la referencia se miden al mismo tiempo y cualquier cambio que afecte a ambas se cancela de forma continua. En un instrumento de haz simple, la deriva de la fuente, la deriva del detector y un cambio de temperatura en el compartimento entran todos en el resultado entre la lectura de la referencia y la de la muestra; la puesta a cero periódica elimina la mayor parte de eso, que es la razón de que los instrumentos de haz simple sigan siendo perfectamente adecuados para trabajo de rutina.

La diferencia merece pagarse en dos situaciones: una medición que tenga que mantenerse estable durante un periodo largo, y un método en el que la diferencia de absorbancia entre la muestra y la referencia sea lo bastante pequeña como para que la deriva sea una parte significativa de ella. El LC-UV1800 lleva además el ancho de banda más fino de la gama, 1,8 nm, así que es el instrumento para un laboratorio que necesita a la vez un ancho de banda estrecho y estabilidad, y no para uno que simplemente quiera lo más alto de la lista.

Cubetas, compartimento y consumibles

Todos los modelos se suministran con un portacubetas de cuatro posiciones, ya sea un portacubetas fijo de 1 cm o, en algunos modelos, uno ajustable de 0,5-5 cm, y con una caja de cuatro cubetas de vidrio de 1 cm. Los modelos UV añaden dos cubetas de cuarzo. Ese es el conjunto, y el punto que hay que retener es que el vidrio no transmite en el ultravioleta: cualquier medición por debajo de unos 320 nm necesita cubetas de cuarzo, solo vienen con los modelos UV y hay que pedirlas por separado. Las cubetas de cuarzo adicionales son un artículo de pedido por derecho propio y no un accesorio que pueda tomarse prestado de otro instrumento.

El paso óptico del portacubetas importa igual que el ancho de banda: la absorbancia es proporcional a la distancia que la luz recorre a través de la muestra, así que un portacubetas de 0,5 cm y uno de 5 cm miden cantidades distintas de la misma disolución. Cuando un método indica un paso óptico, el portacubetas tiene que coincidir con él, y cuando hay que leer una muestra diluida sin concentrarla, un paso óptico mayor sube la absorbancia al intervalo útil.

Limitaciones de medición y criterios de selección

Varios parámetros que importan en un laboratorio no se indican en ninguna parte del material: la alimentación de red, el tiempo de calentamiento, los límites de temperatura y humedad ambiente, el intervalo de sustitución de la fuente, el grado de protección de la carcasa y la vida de la fuente de luz por modelo. Aquí no se deduce nada para rellenar esos huecos, y la propia nota del material de que sus cifras son valores nominales del proveedor, que deben confirmarse contra la placa de características y el manual entregados, se aplica a toda la página.

Merece la pena enunciar con claridad dos límites operativos. El instrumento pesa entre 7 kg y 12,5 kg según el modelo y es un aparato de sobremesa cuyo camino óptico es sensible a la vibración, así que su sitio es un banco estable y no un carro compartido. Y las lámparas son consumibles con una vida nominal de 1000 h o 2000 h según el modelo, que el material señala que se acorta con los encendidos y apagados frecuentes, así que un instrumento que se usa a lo largo de toda la jornada está mejor dejándolo encendido que apagándolo y encendiéndolo alrededor de cada medición.

Cuando el instrumento se vaya a usar para ensayos reglamentados, los documentos de cualificación son un requisito aparte. El material hace constar que la documentación de certificación se retiró en origen y que no se incluye información de certificados, y aconseja solicitar al proveedor el certificado de aprobación de tipo y los documentos de validación 3Q para ensayos farmacéuticos y alimentarios. Eso es una cuestión para la consulta y no un supuesto que se deduzca del suministro.

Pedido

Los elementos que deciden la respuesta son la longitud o las longitudes de onda que utiliza el método, la anchura del pico y por tanto el ancho de banda necesario, si basta con el funcionamiento a longitud de onda única o hay que registrar un espectro, si la región ultravioleta hace falta o no, el paso óptico de las cubetas, si los resultados tienen que capturarse en un ordenador y qué documentos exige el sistema de calidad del laboratorio. Conviene indicar el método y no solo el modelo siempre que sea posible, porque la longitud de onda y la anchura del pico son lo que fija la lista de modelos y no al contrario. Cantidad, puerto de destino y fecha de entrega requerida completan la consulta.