Spectrophotomètre UV-visible

Un spectrophotomètre ne répond pas au même type de question que la plupart des appareils qui l’entourent. Il n’énonce pas directement une propriété de l’échantillon ; il énonce quelle quantité de lumière l’échantillon a absorbée à une longueur d’onde choisie par quelqu’un, et tout le reste - la concentration, la pureté, le fait qu’une réaction se soit portée où elle devait - est déduit de cela. Le choix qui décide de toute la suite est donc celui des longueurs d’onde que l’appareil peut atteindre et de la finesse avec laquelle il peut les séparer.

Cette gamme couvre neuf modèles en deux séries. La série V travaille dans le visible sur une lampe à tungstène ; la série UV ajoute une lampe à xénon et descend jusqu’à 190 nm. De part et d’autre, la largeur de bande spectrale va de 5 nm à 1,8 nm, l’exactitude de la longueur d’onde de 2 nm à ±0,5 nm, et tous les modèles sauf un travaillent à simple faisceau.

Ce que mesure l’appareil

Quatre grandeurs sont rendues : la transmittance, l’absorbance, la concentration et le facteur de pente qui relie les deux dernières. La transmittance est la fraction de la lumière incidente qui traverse l’échantillon. L’absorbance est son logarithme changé de signe, soit la grandeur proportionnelle à la concentration dans le domaine de travail, et celle dans laquelle la plupart des mesures sont réellement prises. La concentration découle de l’absorbance par un facteur établi contre des étalons de concentration connue, et le facteur de pente est cette conversion conservée par l’appareil.

Comme la relation entre absorbance et concentration n’est linéaire que dans certaines limites, la plage de mesure utile est plus étroite que ne le suggère l’échelle. Un échantillon trop concentré se lit comme s’il était dilué, parce que la relation cesse d’être linéaire avant que le détecteur n’épuise son signal. C’est une propriété de la méthode plutôt que de l’appareil, et c’est pourquoi le choix du trajet optique et de la dilution compte autant que celui du modèle retenu.

Comment la mesure est conduite

La lumière de la lampe est dispersée par un réseau holographique de 1200 traits par millimètre dans un monochromateur de Czerny-Turner, qui transforme le large spectre de la source en une bande étroite à la longueur d’onde choisie. Ce faisceau monochromatique traverse l’échantillon, et l’intensité parvenant au détecteur est comparée à celle que lui a donnée une référence. Le rapport est la transmittance, et le logarithme de son inverse est l’absorbance.

Trois choses découlent de ce montage. La première est que la source et le détecteur font partie de la mesure au même titre que l’échantillon, ce qui explique que la durée de vie des sources et la dérive figurent au tableau. La dérive est annoncée à ≤0,003 A sur tous les modèles, et c’est elle qui décide si une faible différence d’absorbance est crédible au cours d’une longue série. La seconde est que le monochromateur fixe le pouvoir séparateur : le réseau est commun à la gamme, mais la largeur de fente qui le suit, annoncée en largeur de bande spectrale, ne l’est pas, et c’est la largeur de bande et non le réseau qui décide si deux pics proches restent séparés. La troisième est que la référence compte. Chaque mesure est un rapport, si bien que tout ce qui change entre la lecture de référence et la lecture de l’échantillon se retrouve dans le résultat, sauf si l’optique mesure les deux à la fois ou si l’appareil est remis à zéro assez souvent.

Choisir entre la série visible et la série ultraviolet

La série visible atteint 320-1100 nm, sauf sur LC-V1200E où la plage est de 350-1050 nm. La série ultraviolet atteint 190-1100 nm sur tous les modèles, la plage supplémentaire venant d’une lampe à xénon placée aux côtés de la lampe à tungstène. Rien d’autre dans la spécification ne tranche cette question : une méthode écrite en deçà d’environ 320 nm ne peut pas être suivie sur un appareil visible, faute de lumière qui puisse y être absorbée, et une méthode écrite au-dessus de cette longueur d’onde n’a pas besoin de la série ultraviolet à moins qu’autre chose dans le même laboratoire ne la réclame.

Lorsque les deux régions sont nécessaires sur un seul appareil, la série UV couvre le visible dans le même boîtier, si bien qu’il n’y a aucune raison d’acheter aussi la série visible. Lorsque le travail est entièrement dans le visible et que le laboratoire n’a pas l’intention de descendre sous 320 nm, les modèles visibles atteignent les mêmes longueurs d’onde avec le même réseau, sur une spécification moindre.

Largeur de bande, et pourquoi elle décide de la séparation de deux pics

La largeur de bande spectrale est la largeur de la bande de longueurs d’onde que l’appareil laisse réellement passer à un réglage donné ; elle va ici de 5 nm à 1,8 nm. Une grande largeur de bande n’est pas simplement une lecture plus grossière : elle moyenne tout ce qui tient dans cette fenêtre, si bien que deux pics d’absorption distants de quelques nanomètres sont rendus comme un seul épaulement large, et aucun soin pris ailleurs ne les récupère. Il faut une largeur de bande nettement plus étroite que le pic mesuré, et lorsqu’une méthode énonce une largeur de pic, la largeur de bande se choisit directement contre elle.

C’est la raison pour laquelle la gamme couvre un facteur de près de trois en largeur de bande sur neuf modèles. Lorsqu’une méthode lit un pic visible large à longueur d’onde fixe, une bande de 4 nm ou de 5 nm n’est pas un compromis. Lorsqu’elle met en jeu un pic étroit, un épaulement, ou deux pics à séparer, ce sont les modèles à 1,8 nm ou à 2 nm qui le peuvent.

Longueur d’onde unique ou balayage

Les modèles de base sont réglés sur une longueur d’onde unique et y lisent l’échantillon, ce que demande un dosage de routine, et c’est la façon la plus rapide de le conduire. Les modèles N et NC, le Pro et le 1800 balaient : la longueur d’onde se déplace en continu et le spectre est enregistré sur une plage, ce qu’exigent la recherche d’un pic, la comparaison d’un échantillon à un spectre de référence, ou l’établissement que rien d’inattendu n’absorbe ailleurs dans la plage.

Le balayage n’est pas réservé au travail de recherche. Toute méthode qui doit être validée dans le laboratoire, ou qui peut être dérangée par une substance interférente, se défend mieux avec un spectre qu’avec un seul point, et un spectre relevé une fois tranche souvent une discussion ultérieure. Lorsqu’une méthode est fixée à une longueur d’onde et que la réponse est simplement le nombre lu à cette longueur d’onde, la longueur d’onde unique n’est pas une limite et les modèles à balayage ne sont pas nécessaires.

Simple faisceau et double faisceau

Huit des neuf modèles travaillent à simple faisceau, ce qui mesure la référence et l’échantillon à des instants différents et compte sur la remise à zéro pour garder les deux comparables. LC-UV1800 travaille à double faisceau, ce qui sépare la lumière pour que l’échantillon et la référence soient mesurés en même temps et que toute variation affectant les deux s’annule en continu. Dans un appareil à simple faisceau, la dérive de la source, celle du détecteur et un changement de température du compartiment entrent tous dans le résultat entre la lecture de référence et la lecture de l’échantillon ; la remise à zéro périodique retire l’essentiel de cet effet, ce qui explique que les appareils à simple faisceau restent parfaitement suffisants en routine.

La différence vaut son prix dans deux situations : une mesure qui doit rester stable longtemps, et une méthode où la différence d’absorbance entre l’échantillon et la référence est assez faible pour que la dérive en constitue une part notable. LC-UV1800 porte aussi la largeur de bande la plus fine de la gamme, à 1,8 nm, si bien que c’est l’appareil d’un laboratoire qui a besoin d’une bande étroite et de stabilité, non de celui qui veut simplement le haut de la liste.

Cuvettes, compartiment et consommables

Tous les modèles sont livrés avec un porte-cuvettes à quatre positions, soit une version fixe de 1 cm soit, sur certains modèles, une version réglable de 0,5 à 5 cm, et une boîte de quatre cuvettes en verre de 1 cm. Les modèles UV ajoutent deux cuvettes en quartz. C’est l’ensemble, et le point à retenir est que le verre ne transmet pas dans l’ultraviolet : toute mesure en deçà d’environ 320 nm demande des cellules en quartz, qu’elles ne viennent qu’avec les modèles UV et qu’il faut les commander à part. Des cellules en quartz supplémentaires sont un article de commande à part entière, non un accessoire qu’on emprunte à un autre appareil.

Le trajet optique du porte-cuvettes compte de la même manière que la largeur de bande : l’absorbance est proportionnelle à la distance que parcourt la lumière dans l’échantillon, si bien qu’un porte-cuvettes de 0,5 cm et un porte-cuvettes de 5 cm ne mesurent pas la même quantité de la même solution. Lorsqu’une méthode énonce un trajet optique, le porte-cuvettes doit lui correspondre, et lorsqu’un échantillon dilué doit être lu sans être concentré, un trajet optique plus long remonte l’absorbance dans le domaine utile.

Limites de mesure et critères de choix

Plusieurs paramètres qui comptent au laboratoire ne sont indiqués nulle part dans le document : l’alimentation secteur, le temps de chauffe, les limites de température et d’humidité ambiantes, l’intervalle de remplacement des lampes, l’indice de protection du boîtier et la durée de vie de la source pour chaque modèle. Rien ici n’est déduit pour combler ces trous, et la note du document rappelant que ses valeurs sont nominales et doivent être confirmées contre la plaque signalétique et la notice livrées s’applique à toute la page.

Deux limites d’exploitation méritent d’être dites clairement. L’appareil pèse entre 7 kg et 12,5 kg selon le modèle et c’est un appareil de paillasse dont le chemin optique est sensible aux vibrations, si bien qu’il est à poser sur une paillasse stable plutôt que sur un chariot partagé. Et les lampes sont des consommables d’une durée annoncée de 1000 h ou de 2000 h selon le modèle, durée que le document dit raccourcie par des mises sous tension fréquentes, si bien qu’un appareil utilisé toute une journée vaut mieux laissé en marche qu’allumé et éteint autour de chaque mesure.

Lorsque l’appareil doit servir à des essais réglementés, les documents de qualification sont une exigence distincte. Le document consigne que les éléments de certification ont été retirés à la source et qu’aucune information de certificat n’est fournie, et il conseille de demander au fournisseur le certificat d’agrément de type et les documents de validation 3Q pour les essais pharmaceutiques et alimentaires. C’est une question pour la demande de devis, pas une hypothèse tirée de la livraison.

Commander

Les éléments qui décident de la réponse sont la ou les longueurs d’onde qu’utilise la méthode, la largeur des pics et donc la largeur de bande nécessaire, le fait qu’une longueur d’onde unique suffise ou qu’un spectre doive être enregistré, le besoin ou non de la région ultraviolette, le trajet optique des cellules, la capture ou non des résultats sur un ordinateur, et les documents qu’exige le système qualité du laboratoire. Énoncez la méthode plutôt que le seul modèle lorsque c’est possible, car ce sont la longueur d’onde et la largeur du pic qui fixent la liste des modèles, et non l’inverse. Quantité, port de destination et date de livraison requise complètent la demande.