Che cos'è uno spettrofotometro
Uno spettrofotometro misura quanta luce un campione assorbe a una lunghezza d'onda scelta. Poiché molte sostanze assorbono la luce in proporzione alla loro concentrazione, lo strumento trasforma una lettura di assorbanza in un risultato quantitativo: è per questo che lo si trova nelle prove sulle acque e sui reflui, nell'analisi degli alimenti e delle bevande, nel controllo qualità farmaceutico e in ogni laboratorio che segue un metodo colorimetrico.
Il caso più comune è il visibile: nel campione si sviluppa un complesso colorato e lo strumento misura quanto fortemente assorbe. L'ultravioletto estende la misura alle sostanze che sono incolori ma assorbono comunque al di sotto della banda visibile, e richiede una lampada diversa e un diverso materiale per le cuvette. Le due bande sono spesso volute nello stesso laboratorio, e per questo l'intervallo di lunghezze d'onda è la prima cosa da stabilire.
Ciò che distingue uno strumento dall'altro non è il display, ma come la luce è prodotta, separata e rilevata: l'intervallo di lunghezze d'onda, la larghezza di banda spettrale, se il fascio è singolo o doppio, il tipo di lampada e il formato di cuvetta che il lavoro richiede. Questa pagina copre questi aspetti e il confine con gli strumenti analitici vicini, che sullo stesso banco rispondono a domande diverse.
Come misura uno spettrofotometro
Lo strumento fa passare la luce attraverso un monocromatore, un reticolo o un filtro, per isolare una banda stretta alla lunghezza d'onda scelta, la invia attraverso il campione e misura ciò che arriva al rilevatore. L'assorbanza è calcolata dal rapporto tra la luce trasmessa dal campione e la luce trasmessa da un riferimento, e per questo la misura del bianco fa parte di ogni metodo anziché essere un'aggiunta facoltativa.
La relazione tra assorbanza e concentrazione è lineare solo entro limiti precisi, e solo in un sistema ben comportante. Al di sopra di una certa assorbanza la linearità si perde, gli effetti di matrice del campione interferiscono e la lettura smette di essere una misura affidabile della concentrazione. Un metodo definisce quindi non solo la lunghezza d'onda, ma anche il cammino ottico, il reagente e l'intervallo entro cui la taratura è stata stabilita.
Larghezza di banda e luce parassita decidono cosa lo strumento può fare agli estremi del suo intervallo. Una banda stretta risolve un picco di assorbimento accentuato che una banda larga appiattirebbe e sottostimerebbe; la luce parassita limita la massima assorbanza a cui ci si può fidare, perché ad alta assorbanza la piccola frazione parassita diventa una frazione grande della luce che raggiunge il rilevatore. Sono entrambi dati di specifica, non regolazioni di esercizio.
Opzioni di configurazione
La maggior parte della specifica è definita da queste decisioni e non dalla classe di accuratezza. Ognuna vincola la successiva, ed è per questo che si chiariscono in ordine.
| Configurazione | Opzioni da definire | Cosa decide davvero |
| Intervallo di lunghezze d'onda | Solo il visibile, oppure ultravioletto e visibile insieme | Quali sostanze e quali metodi normalizzati lo strumento può eseguire, e quale lampada e quale materiale per le cuvette servono. |
| Larghezza di banda spettrale | L'ampiezza della banda di luce che raggiunge il campione | Se un picco di assorbimento accentuato è risolto correttamente. Un picco misurato con una banda troppo larga risulta basso, e la taratura assorbe quell'errore finché lo strumento non cambia. |
| Assetto ottico | Fascio singolo, oppure fascio doppio con un canale di riferimento | Se il riferimento è misurato insieme al campione. Il fascio doppio compensa la deriva della lampada e del rilevatore, cosa che conta su una lunga serie di campioni. |
| Sorgente di luce | La lampada o le lampade montate, e l'intervallo che ciascuna copre | Quale estremo dell'intervallo di lunghezze d'onda è disponibile. La banda ultravioletta chiede una sorgente propria, e il punto di passaggio fra le sorgenti è un dettaglio di specifica. |
| Rilevatore | Il tipo di rilevatore e l'intervallo a cui risponde | La sensibilità agli estremi dell'intervallo di lunghezze d'onda e il livello di rumore della lettura. |
| Formato del campione | Cuvette normali, celle a microvolume, celle a flusso e portatubi o portavial | Se il metodo può essere eseguito come è scritto e quanto campione consuma. Un formato a microvolume vale qualcosa solo se i campioni sono davvero piccoli. |
| Software e memorizzazione dei metodi | Metodi incorporati, curve di taratura memorizzate e possibilità di esportare i risultati | Se il lavoro routinario è un metodo memorizzato o una sequenza manuale, e se i risultati devono essere documentati. |
| Accuratezza di lunghezza d'onda e verifica | Come è impostata l'accuratezza di lunghezza d'onda e quali filtri o campioni di riferimento sono forniti | Se si può dimostrare che lo strumento legge alla lunghezza d'onda che il metodo richiede, cosa che un laboratorio accreditato deve mostrare. |
Come scegliere uno spettrofotometro
| Criterio | Perché determina la risposta | Come chiarirlo prima della richiesta |
|---|
| Cosa viene misurato | Un colore, una concentrazione con un metodo normalizzato o una scansione su un intervallo pongono richieste diverse | Indichi la sostanza e il metodo, oppure descriva quale informazione vuole dalla lettura. |
| Banda di lunghezze d'onda necessaria | Decide la lampada, il materiale delle cuvette e spesso la fascia di costo dello strumento | Indichi le lunghezze d'onda richieste dal metodo e se qualcuna sta sotto l'intervallo visibile. |
| Larghezza di banda richiesta dal metodo | Un metodo scritto attorno a un picco ha bisogno di una banda capace di risolverlo | Citi il metodo, comprese lunghezza d'onda e larghezza di banda dove le indica. |
| Intervallo di concentrazione | Fissa il cammino ottico e la diluizione che il metodo richiederà | Indichi la concentrazione minima e massima attesa. |
| Volume di campione disponibile | Alcuni metodi e alcuni campioni sono limitati nel volume | Indichi quanto campione c'è per singola determinazione. |
| Numero di campioni e produttività | Decide se uno strumento a fascio singolo è adeguato o se un fascio doppio fa risparmiare tempo | Indichi la dimensione del lotto e con quale frequenza il lavoro è eseguito. |
| Requisito documentale | Il lavoro accreditato richiede di solito registrazioni e verifica dello strumento | Indichi se i risultati devono essere documentati e se servono campioni di riferimento per la verifica. |
Se qualcuno di questi punti è ancora aperto, invii quanto è già noto. Un preventivo può essere emesso sulla base della descrizione dell'applicazione e precisato quando i punti in sospeso saranno chiariti.
Le alternative più vicine
Questi sono i tipi in cui una richiesta per uno spettrofotometro si risolve di solito, e il punto in cui la scelta si decide davvero.
| Alternativa più vicina | Cosa lo distingue da uno spettrofotometro |
| Colorimetri | Isolano una banda con un filtro anziché selezionare una lunghezza d'onda con un monocromatore, quindi sono più semplici e adatti a un metodo che definisce una sola reazione colorata. Non possono scansionare uno spettro né risolvere un picco stretto, e questo li rende uno strumento da routine fissa e non da messa a punto di metodi. |
| Spettrometri di assorbimento atomico | Misurano l'assorbimento della luce da parte degli atomi in una fiamma o in un forno, per determinare la concentrazione di un elemento spesso a livelli molto bassi. Rispondono a quali elementi sono presenti e in quale quantità, mentre uno strumento UV-Vis di solito risponde a quanto di un composto è presente. |
| Cromatografi gas | Separano una miscela nei suoi componenti prima di misurarli, cosa che uno spettrofotometro non può fare. Quando il campione contiene più sostanze che assorbono alla stessa lunghezza d'onda, è quella separazione a rendere possibile la misura. |
| Cromatografi liquidi | Lo stesso principio di separazione applicato in fase liquida, spesso accoppiato a un rilevatore spettrofotometrico. La distinzione è che la cromatografia fornisce la separazione: il rilevatore riferisce soltanto ciò che lo attraversa. |
| Analizzatori TOC | Misurano il carbonio organico totale ossidando il campione e rilevando l'anidride carbonica che ne risulta. Riferiscono un valore complessivo di carico organico, mentre un metodo spettrofotometrico misura una sostanza o una reazione specifica. |
| Spettrometri di massa | Identificano i composti dal rapporto massa/carica, dando informazioni strutturali e di conferma. Sono un'altra categoria di strumento per costo e per gestione, e si usano quando il requisito è l'identificazione anziché la quantificazione routinaria. |
Il confine da stabilire per primo è quello tra un colorimetro e uno spettrofotometro. Dove il metodo nomina una sola lunghezza d'onda per una sola reazione colorata, un colorimetro può bastare; dove un metodo va messo a punto o trasferito, è la selettività in lunghezza d'onda di uno spettrofotometro a renderlo possibile.
Cosa includere nella richiesta
La prima risposta può essere un preventivo anziché una serie di domande, se la richiesta le contiene. Dove un valore non è noto, invii la descrizione del compito di misura e confermeremo ciò che implica.
- La sostanza o il parametro da misurare e il metodo da seguire
- La lunghezza d'onda o l'intervallo di lunghezze d'onda che il metodo richiede
- La larghezza di banda indicata dal metodo, quando ne indica una
- L'intervallo di concentrazione atteso
- Il volume di campione disponibile per singola determinazione
- Se il lavoro è un metodo di routine fisso o una gamma di metodi
- La dimensione del lotto e con quale frequenza il lavoro è eseguito
- Se i risultati devono essere documentati o esportati
- Quantità, porto di destinazione e data di consegna richiesta
